單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq）作為一種高通量測(cè)序技術(shù)，它允許研究者在單個(gè)細(xì)胞水平上測(cè)量基因表達(dá)，揭示細(xì)胞群體內(nèi)部的異質(zhì)性，識(shí)別不同細(xì)胞類型或狀態(tài)的基因表達(dá)模式，為細(xì)胞生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、疾病研究和藥物發(fā)現(xiàn)等領(lǐng)域的研究提供了新的維度和深度。

單細(xì)胞RNA測(cè)序技術(shù)起始于單細(xì)胞分離，Bio-Techne單細(xì)胞柔性系統(tǒng)Pala為單細(xì)胞分選提供了快速便捷的途徑。以下實(shí)驗(yàn)通過單細(xì)胞柔性分選系統(tǒng)Pala分選經(jīng)細(xì)胞活性染料及特異性熒光抗體標(biāo)記的單個(gè)活化B細(xì)胞。通過對(duì)靜息及活化B細(xì)胞基因表達(dá)分析研究活化對(duì)基因表達(dá)的影響。

實(shí)驗(yàn)步驟

（1）利用mCD40L-3T3飼養(yǎng)細(xì)胞對(duì)人原代記憶B細(xì)胞活化6天。收集活化后細(xì)胞并用抗人CD27-PE抗體及細(xì)胞活性染料CellTrackerGreen進(jìn)行染色。

（2）在板中加入每孔4微升裂解液，利用單細(xì)胞柔性分選系統(tǒng)Pala將PE及FITC陽(yáng)性細(xì)胞分選至96孔PCR板中。細(xì)胞裂解后進(jìn)行cDNA合成及RNA建庫(kù)測(cè)序。

（3）每孔中進(jìn)行VH及VL抗體可變區(qū)基因特異性擴(kuò)增（qPCR）。

（4）基因文庫(kù)利用Illumina Nextseq進(jìn)行測(cè)序，比較活化及靜息狀態(tài)下B細(xì)胞的基因表達(dá)差異。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

（1）單細(xì)胞分離效率：經(jīng)過擴(kuò)增后，96孔中有93孔含有cDNA（97%）。

（2）單細(xì)胞驗(yàn)證：Sanger測(cè)序表明所有的孔中都是單個(gè)細(xì)胞，不存在二聚體的情況。

（3）免疫球蛋白基因表達(dá)：免疫球蛋白qPCR結(jié)果顯示所有所有樣品中均表達(dá)重鏈IGVH，輕鏈僅表達(dá)kappa或lambda（IGVK、IGVL）中的一種。