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蛋白質(zhì)為什么“這么容易壞”?怎么穩(wěn)定蛋白質(zhì)?

更新時(shí)間:2026-08-11點(diǎn)擊次數(shù):73

很多普通人提到蛋白質(zhì),第一反應(yīng)往往是日常補(bǔ)身體的“營養(yǎng)品"、健身人群用來增肌塑形的“增肌粉",是一種幫助維持身體狀態(tài)、增長肌肉的營養(yǎng)補(bǔ)充物。


但在生物醫(yī)藥研發(fā)生產(chǎn)、體外診斷試劑開發(fā)、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)用工具酶制備這些專業(yè)應(yīng)用場景里,蛋白質(zhì)的角色和屬性不同,它更像一臺(tái)經(jīng)過精準(zhǔn)折疊組裝,依靠水分子作用力以及分子間各類弱相互作用來維持自身構(gòu)型的精密儀器:

•  它必須依靠自身形成的特定三維空間結(jié)構(gòu),才能夠精準(zhǔn)完成催化生化反應(yīng)、特異性結(jié)合靶點(diǎn)、識別目標(biāo)分子這些核心生物學(xué)功能,一旦結(jié)構(gòu)改變,功能也會(huì)隨之喪失;

•  它的空間結(jié)構(gòu)并不是像金屬構(gòu)件那樣被固定、焊死不能變動(dòng)的,而是始終處在“整體可動(dòng)、構(gòu)象呼吸、局部微振動(dòng)"的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)中,維持著功能所需的柔性;

•  也正是因?yàn)檫@種動(dòng)態(tài)的、依靠弱作用力維持的結(jié)構(gòu)特性,它對外界環(huán)境的各類變化都非常敏感,溫度的高低波動(dòng)、環(huán)境酸堿度的偏移、體系中鹽離子濃度的改變、容器與溶液的界面作用、加工過程中的剪切力、反復(fù)凍融的處理,都很容易破壞它原本的結(jié)構(gòu)。


蛋白質(zhì)在從生物原料中完成分離純化、得到具備活性的成品后,往往需要儲(chǔ)存數(shù)周到數(shù)年不等的時(shí)間,而要在這段漫長的儲(chǔ)存時(shí)間里,一直維持它剛純化完成時(shí)的原始生物學(xué)功能,就必須從各個(gè)環(huán)節(jié)入手,避免各種可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)失去活性的失活過程(inactivation processes)。




01.  蛋白質(zhì)的“穩(wěn)定",到底穩(wěn)定什么?


蛋白質(zhì)為什么“這么容易壞


對蛋白質(zhì)樣品而言,“穩(wěn)定"的概念至少包含三層清晰明確的含義:

第一層是結(jié)構(gòu)穩(wěn)定:也就是蛋白質(zhì)要始終維持純化后正確的空間構(gòu)象,不能發(fā)生整體解折疊,也不能形成錯(cuò)誤的折疊結(jié)構(gòu)(denaturation/misfolding)。


第二層是物理穩(wěn)定:也就是蛋白質(zhì)分子不能相互聚集形成大的團(tuán)聚體,不能從溶液中析出發(fā)生沉淀,不能吸附粘附在儲(chǔ)存容器的內(nèi)壁上,也不能在氣液界面發(fā)生過度聚集(aggregation/precipitation/adsorption)。


第三層是化學(xué)穩(wěn)定:也就是蛋白質(zhì)的共價(jià)化學(xué)結(jié)構(gòu)不能發(fā)生改變,不能被氧化、發(fā)生脫酰胺反應(yīng)、出現(xiàn)構(gòu)象異構(gòu)化、肽鏈斷裂,也不能發(fā)生其他類型的不可逆化學(xué)修飾(oxidation/deamidation/isomerization…)。


這三層穩(wěn)定并不是平行、互不干擾的并列關(guān)系,相互之間存在明確的先后影響邏輯:

•  蛋白質(zhì)原本正確的空間結(jié)構(gòu)一旦受到外界因素?cái)_動(dòng)發(fā)生改變,通常就會(huì)暴露出原本隱藏在分子內(nèi)部的疏水基團(tuán),進(jìn)而更容易觸發(fā)分子間的聚集過程;

•  蛋白質(zhì)發(fā)生的化學(xué)修飾會(huì)改變分子表面的電荷分布與疏水性質(zhì),這些改變又會(huì)進(jìn)一步提升蛋白質(zhì)分子發(fā)生聚集的傾向性;

•  而由物理吸附帶來的樣品損失,比如蛋白質(zhì)分子全部粘到了儲(chǔ)存管的管壁上,會(huì)讓研究人員直觀上“以為蛋白已經(jīng)失活壞掉了",但實(shí)際上只是可檢測的有效蛋白樣品不見了。




02.  為什么蛋白質(zhì)這么容易壞?


蛋白質(zhì)為什么“這么容易壞


蛋白質(zhì)之所以如此脆弱,本質(zhì)根源要追溯到它維持自身結(jié)構(gòu)的“架構(gòu)材料"與作用機(jī)制。它的完整空間結(jié)構(gòu),是由一堆強(qiáng)度有限的弱相互作用一點(diǎn)點(diǎn)拼接搭建起來的:

•  由疏水效應(yīng)驅(qū)動(dòng)折疊形成的、包裹在分子內(nèi)部的疏水內(nèi)核。

•  維持多肽鏈局部規(guī)則構(gòu)象的氫鍵網(wǎng)絡(luò),這也是蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)形成的核心基礎(chǔ)。

•  維持不同結(jié)構(gòu)區(qū)域電荷平衡與空間穩(wěn)定的靜電相互作用與鹽橋。

•  讓不同肽鏈或不同結(jié)構(gòu)基團(tuán)緊密貼合的范德華作用,比如部分蛋白質(zhì)中的二硫鍵,就會(huì)為整體結(jié)構(gòu)起到類似“鉚釘"的加固作用。


這些維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的相互作用,每一個(gè)單獨(dú)的結(jié)合強(qiáng)度都非常低,但無數(shù)個(gè)弱相互作用組合在一起,就足以支撐蛋白質(zhì)折疊成特定的三維空間構(gòu)象,維持發(fā)揮正常生理功能所需的活性狀態(tài)。而問題恰恰也出在這里:

弱相互作用的穩(wěn)定性對環(huán)境高度敏感,只要環(huán)境條件發(fā)生一點(diǎn)點(diǎn)改變,原本維持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的平衡就很容易被打破推倒。梳理目前已知的會(huì)引發(fā)蛋白質(zhì)失活的主要觸發(fā)因素,我們可以發(fā)現(xiàn)其中存在一個(gè)非常關(guān)鍵的類別:

•  溶液環(huán)境條件的改變,例如溶液濃度被稀釋、環(huán)境溫度發(fā)生大幅波動(dòng)、溶液pH偏離蛋白質(zhì)適宜區(qū)間。

•  溶液物理狀態(tài)的改變,例如對蛋白溶液反復(fù)進(jìn)行凍融操作。




03.  現(xiàn)實(shí)中蛋白是怎么“壞掉"的?


你可以把蛋白質(zhì)發(fā)生失活的過程,想象成三條特征清晰、機(jī)理各異的常見原因:

(1)  蛋白質(zhì)分子本身的高級結(jié)構(gòu)被外部因素?cái)_動(dòng)破壞 → 原本包埋在分子內(nèi)部的疏水結(jié)構(gòu)域暴露在水溶液中 → 暴露的疏水區(qū)域相互結(jié)合最終形成蛋白聚集:

能夠觸發(fā)這一路線的因素十分多樣,溫度異常上升、溶液pH偏離蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的適宜窗口、體系中存在高濃度強(qiáng)鹽或者化學(xué)變性劑、氣液或固液界面產(chǎn)生的界面應(yīng)力都可能觸發(fā)這一過程。


(2)  蛋白質(zhì)分子上的活性化學(xué)位點(diǎn)發(fā)生共價(jià)修飾改寫 → 蛋白質(zhì)分子的整體性質(zhì)發(fā)生改變 → 結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性大幅下降,更容易發(fā)生聚集或直接失活:

比如氧化反應(yīng)會(huì)直接改變蛋白質(zhì)分子原有的疏水分布和表面電荷分布;脫酰胺反應(yīng)或者異構(gòu)化反應(yīng)會(huì)改變蛋白質(zhì)分子局部的空間精細(xì)結(jié)構(gòu);還有不少這類化學(xué)修飾反應(yīng)本身,就和體系的pH值、環(huán)境溫度高度相關(guān)(比如一些硫醇類試劑,在更高pH、更高溫度的環(huán)境中半衰期會(huì)明顯更短,更容易引發(fā)修飾反應(yīng))。


(3)  蛋白質(zhì)分子本身的結(jié)構(gòu)其實(shí)沒發(fā)生“損壞"變質(zhì),但你再也無法從體系中回收得到完整的目標(biāo)蛋白:

低濃度條件下的蛋白質(zhì)會(huì)強(qiáng)烈吸附到容器管壁(玻璃材質(zhì)或塑料材質(zhì))以及過濾分離用的介質(zhì)表面,最終造成有效蛋白的大量損失。我們都知道蛋白在低濃度條件下(例如濃度<50 μg/mL時(shí))往往更不穩(wěn)定,其中一個(gè)十分重要的原因就是這種吸附損失的影響會(huì)變得格外顯著。


這三條失活路線,在蛋白質(zhì)應(yīng)用的不同場景里,影響的權(quán)重并不相同,需要結(jié)合具體條件分析判斷。




04.  “高"不是一個(gè)動(dòng)作,而是一段旅程(溫度、pH、微生物、凍融都在路上)


蛋白質(zhì)在完成純化操作、正式開展實(shí)驗(yàn)之前的存放等待階段,可能會(huì)面臨多種常見的失活風(fēng)險(xiǎn),具體可以分為以下幾類:

(1)  溫度波動(dòng):包括短時(shí)間在室溫環(huán)境下敞放暴露、實(shí)驗(yàn)過程中反復(fù)將蛋白樣品從冰箱中取出又放回導(dǎo)致的溫度反復(fù)變化。

(2)  pH漂移:包括配制緩沖液時(shí)緩沖容量設(shè)計(jì)不足、緩沖液開放放置過程中吸收空氣中的二氧化碳、凍融過程改變體系離子平衡引發(fā)強(qiáng)度變化,比如常用的TRIS緩沖液,不同溫度下pH值會(huì)有較大變化,可能在常溫下是合適的pH值,但是在低溫條件下其實(shí)蛋白正處于pH不合適的煎熬中。

(3)  凍融損傷:包括冷凍過程中冰晶生長產(chǎn)生的排擠效應(yīng)、水分結(jié)晶析出后導(dǎo)致溶質(zhì)濃度異常升高、凍融過程中形成新的氣液界面帶來的剪切作用。

(4)  微生物污染:通常可以通過添加疊氮鈉等試劑抑制微生物生長,但這類抑菌試劑本身帶有毒性,也可以通過0.22 μm濾膜過濾的方式實(shí)現(xiàn)樣品無菌化處理。


蛋白質(zhì)儲(chǔ)存的穩(wěn)定性本身是一項(xiàng)涉及多環(huán)節(jié)的體系工程——最終的儲(chǔ)存效果既和目標(biāo)蛋白質(zhì)自身的分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)有關(guān),也和儲(chǔ)存所用的容器材質(zhì)、實(shí)驗(yàn)操作的流程規(guī)范、樣品運(yùn)輸?shù)臏乜胤绞降韧獠恳蛩孛芮邢嚓P(guān)。




05.  先不談高級配方,先把基本功立住


在你還沒開始嘗試那些設(shè)計(jì)復(fù)雜、變量繁多的高級篩選實(shí)驗(yàn)之前,建議你先沉下心來做好三件投入少、見效明確,稱得上是“穩(wěn)賺不賠"的基礎(chǔ)準(zhǔn)備工作:


第一件事,明確蛋白質(zhì)儲(chǔ)存效果的合格判定目標(biāo)窗口。

•  從功能保留維度看,你需要提前鎖定需要檢測的核心指標(biāo):包括蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性、分子結(jié)合能力,以及三級/四級等關(guān)鍵結(jié)構(gòu)指標(biāo);

•  從物理穩(wěn)定性維度看,你需要提前明確需要監(jiān)控的物理指標(biāo):比如蛋白質(zhì)樣品是否產(chǎn)生可溶性聚集、是否存在肉眼可見的不溶顆粒、溶液整體是否產(chǎn)生渾濁;

•  從化學(xué)穩(wěn)定性維度看,你需要提前圈定需要追蹤的化學(xué)指標(biāo):比如蛋白質(zhì)分子特定位點(diǎn)是否發(fā)生氧化、脫酰胺這類影響結(jié)構(gòu)與功能的修飾反應(yīng)。


第二件事,提前固定好影響儲(chǔ)存效果的“環(huán)境三要素"。

•  第一個(gè)核心要素是儲(chǔ)存溫度,你需要提前確認(rèn)并鎖定實(shí)驗(yàn)需要的儲(chǔ)存條件,到底是-80℃深凍、-20℃凍存、2–8℃冷藏還是室溫儲(chǔ)存;

•  第二個(gè)核心要素是儲(chǔ)存體系的pH與緩沖體系,你需要提前明確實(shí)驗(yàn)采用的緩沖液種類、pH參數(shù)并保持全程一致;

•  第三個(gè)核心要素是待儲(chǔ)存蛋白質(zhì)的濃度,你需要提前確認(rèn)實(shí)驗(yàn)統(tǒng)一的蛋白上樣濃度并固定該參數(shù)。


第三件事,專門為“低濃度蛋白質(zhì)儲(chǔ)存場景"提前預(yù)裝好安全防護(hù)帶。

•  你需要在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的早期階段,就把“最終回收率、容器吸附損失"當(dāng)成評價(jià)儲(chǔ)存效果的核心KPI指標(biāo);

•  優(yōu)先開展一輪快速評估,測試低劑量非離子型表面活性劑(如常用的Tween 20)在減少吸附損失上能帶來的實(shí)際收益,以及它可能對蛋白質(zhì)功能、后續(xù)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的潛在副作用。


梳理清楚這些基礎(chǔ)信息,你才能清晰回答最核心的問題:你到底是在什么溫度、什么pH、什么濃度、什么容器里保存哪一種目標(biāo)蛋白。


FIDA 搭載了8個(gè)維度的質(zhì)量表征參數(shù),可以從蛋白的粒徑,PDI,粘度,黏附性,分子分布,熒光效率等維度全方面評估蛋白樣品的性質(zhì),簡單實(shí)驗(yàn),即可完成上述所說的蛋白穩(wěn)定性的優(yōu)化,助力我們找到合適的蛋白純化和儲(chǔ)存條件!



* 本文轉(zhuǎn)載自「FIDA分子互作技術(shù)」微信公眾號



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FIDA源自于丹麥哥本哈根,基于獨(dú)特的層流分散分析技術(shù),對生物分子進(jìn)行精準(zhǔn)表征。同時(shí)從粒徑,熒光以及光譜位移三個(gè)維度檢測分子間親和力,并且獨(dú)特的質(zhì)控體系始終貫穿于檢測過程,使生物分子的檢測不再盲人摸象,精準(zhǔn)把控過程中的每一個(gè)變化。


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